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      1. 單克隆抗體作用機制及檢測方法要點

        治療性單克隆抗體(mAb)作為抗感染劑和免疫調節藥物,主要用于癌癥治療,是制藥行業最活躍的研究和開發領域之一。抗腫瘤抗體藥物包括未偶聯完整的抗體或片段,抗體藥物偶聯物,抗體同位素和雙特異性抗體等。這些抗體分子不是小分子化學藥物,而是復雜的生物學分子,其具有多個并且通常復雜的機制,測量其生物學活性需要專門的技術,因此充分地了解mAb的作用機制進而在早期臨床前階段選擇最佳的候選抗體藥物是十分重要的。

        眾所周知,化合物分子的功能是由其結構決定,mAb也不例外。抗體由抗原結合域(Fab)和可結晶區域(Fc)組成。Fab主要特異性識別腫瘤相關抗原,進而調控下游的信號通路。Fc可以識別并結合表達Fc受體的免疫細胞以及血液中的補體進而介導抗體依賴的細胞毒作用(ADCC), 抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)以及補體依賴的細胞毒作用(CDC)等效應功能,Fc還可以結合FcRn從而在體內不被輕易清除而延長了其在機體內的半衰期。在這里根據抗體的結構,我們將其作用機制分為Fab相關的作用機制和Fc相關作用機制。

        在這里,我們將介紹目前應用最為廣泛的單克隆抗體,即免疫球蛋白(IgG)的作用機制。

        一、Fab相關的作用機制

        1)識別游離的靶點的單抗

        游離存在于血液循環中的細胞因子、促血管生成因子、生物毒素等都可以作為單抗的作用的靶點。蛋白因子通過與受體的結合,傳導信號進入細胞,調控細胞的功能。過量表達的蛋白因子傳導過量的信號,打破細胞的正常功能。毒素和病毒等也必須通過與細胞表面的受體結合進入細胞內部從而發揮作用。中和抗體的作用機制就是通過結合抗原進行中和,使抗原喪失結合受體的能力,進而喪失生物學功能。常見的針對游離靶點的抗體有血管內皮生長因子(VEGF)抗體,腫瘤壞死因子(TNF)抗體,炭疽毒素中和抗體等。

        2)識別細胞表面受體的單抗

        每一種抗體都可以特異性結合特定的抗原靶點。靶點抗原表達在特定細胞表面,具有特定的功能,例如細胞激活、生長或遷移。根據抗體的Fab活性,可以分為結合、拮抗和激活(圖1)。結合型抗體只是結合在靶蛋白表面但并不影響其功能。因此,靶蛋白受體的配體仍然可以與其結合,從而傳遞信號。結合性抗體可以用于標記靶細胞,從而讓其Fc產生效應功能或通過搭載毒素從而殺滅靶細胞。拮抗性抗體封阻受體上的與配體相互作用所需的表位,阻止配體結合產生的信號傳導。常見的那他珠單抗和達替珠單抗均為拮抗性抗體。激活型抗體模擬配體的功能,識別結合靶受體并傳導信號至細胞內部。基于被激活的細胞內信號強弱,激活型抗體可能在治療時使得靶細胞被激活并釋放細胞因子,進而產生副作用。

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        圖1  識別細胞表面受體的單抗的作用機制(Fab dependent)

        二、Fc相關的作用機制

        單克隆抗體通過其Fc部位結合各種Fc?Rs,進而發揮其效應功能,包括ADCC, ADCP和CDC(圖2). 以最常見的IgG1為例,其Fc區域通過結合Fc?RIII(CD16A)激活NK細胞誘導ADCC;與巨噬細胞上Fc?RIII(CD16A),Fc?RII(CD32A)和Fc?RI(CD64)結合,引發ADCP;與補體的C1q結合激活補體引發CDC。Fc 還能夠以pH依賴的方式結合新生的Fc受體(FcRn),避免被核內體降解,從而延長單克隆抗體的半衰期。

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        圖2 單抗隆抗體(IgG1)作用機制(Fc dependent)

        1)ADCC

        ADCC作用是一種細胞介導的免疫防御機制,在靶細胞膜表面抗原結合了特異性的抗體的情況下,激活免疫系統的效應細胞進而裂解靶細胞的作用。因其對已存在的抗體的依賴性,ADCC作用是適應性免疫反應的一部分,也是體液免疫反應的一部分,用于限制和消除感染。經典的ADCC作用由NK細胞介導,巨噬細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞也能介導ADCC作用。比如嗜酸性粒細胞能通過ADCC作用殺死某些特定的寄生蟲。

        體外檢測ADCC效應有幾種方法,一種是標記靶細胞的方法:比如用51Cr或具有膜通透性的甲基酯熒光染料,比如calcein-AM or DELFIA-BATDA,靶細胞標記后,加入抗體孵育,然后再加入NK92/CD16A細胞或者從PBMC純化的NK92,或者PBMC作為效應細胞,不同的效應細胞和靶細胞的比例(E:T),不同的孵育時間(通常低于4小時,更長的孵育時間也是可以的,只是自發釋放會相應變大)。孵育結束后,加入enhancing solution,用不同的儀器檢測放射性同位素和熒光染料,這些方法相對可信但靈敏度不夠。其他一些方法,例如檢測乳酸脫氫酶(LDH)的釋放,這個方法的缺點是由于靶細胞沒有被標記,不能區分效應細胞和靶細胞的釋放,所以也沒有被頻繁使用。最有吸引力的檢測ADCC效應的方法是基于流式細胞術法(FACS)檢測,這種方法通常需要標記靶細胞,或者同時標記靶細胞和效應細胞,然后檢測靶細胞的活細胞的減少量,然而這種方法相對比較復雜,因為FACS檢測時出現至少兩群細胞(包括靶細胞和效應細胞),這需要染雙色或者三色。相比較其他,用FACS 方法檢測ADCC相對可靠,最終結果需要一個獨立的方法來驗證。無論使用哪種方法,效應細胞通常是PBMC或純化的NK細胞。效應細胞需要用IL-2預活化過夜以增強效應細胞的活性,但由于個體的差異,以及FcR?IIIA多態性(158(V或F))的原因,導致同一個抗體的每次ADCC實驗數據差距很大,可重復性差,而使用NK細胞系穩轉CD16A,使體外ADCC實驗變得更穩定,可重復性強。

        2)ADCP

        眾多小鼠體內實驗表明,IgG1的治療性抗體作用與巨噬細胞及其表達的Fc?Rs尤其是Fc?RIV高度依賴(表1),這些細胞不會引發高效的ADCC效應但是會引發ADCP效應,所以了解ADCP的作用機制也是很有必要的。

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        表1  老鼠和人類的Fc?Rs及其表達方式

        測定抗體的ADCP 與ADCC類似,都取決于共孵育的兩種細胞:適應的靶細胞加入到效應細胞中(巨噬細胞或中性粒細胞),共孵育1-2小時,有時候也需要更長的孵育時間。巨噬細胞是貼壁細胞,需要消化后通過流式來分離。與ADCC類似,巨噬細胞的可重復性太差。所以也可以用細胞系,比如THP1,它通常需要被佛波酯激活,但是它的ADCP效果比較弱,需要孵育較長的時間。效應細胞通常是從PBMC通過免疫親和方法富集或純化而來。然后在血清或生長因子例如GM-CSF和/或M-CSF存在下,將它們體外分化4-7天。因此,效應細胞可以廣泛變化,不僅是由于供體關聯的Fc?Rs多態性,而且還由于單核細胞來源,純化程序,分化成巨噬細胞的時間和條件等。所有這些事實意味著吞噬作用不容易標準化。

        吞噬作用的測量依賴于基于顯微鏡或流式細胞術的方法。基于顯微鏡的技術是費力的,而且容易受到操作者的偏見。流式細胞術方法快速和定量,但容易產生偽像,因為樣品中至少有兩個不同的細胞群體存在。此外,即使進行靶細胞和效應細胞的差異標記,雙重陽性事件也不能將結合和吞噬區分開來(圖3)。在某些實驗條件下,靶細胞可能與巨噬細胞結合,但不能被吞噬。此外,靶細胞和巨噬細胞之間的簡單接觸可能導致熒光從一個細胞傳遞到另一個細胞,但不存在吞噬作用。因此,雙陽性細胞可能不代表真正的吞噬作用。有幾種方法可以消除這些問題,例如通過猝滅結合但不攝取的靶細胞的熒光,染料僅在達到溶酶體的酸性環境時變為熒光,因此僅標記能夠吞噬的靶標或者用第三個熒光標記物標記結合但非吞噬的靶標以區分結合和吞噬作用(圖3)。基于這些,流式細胞術分析相對可靠。

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        圖3   區分結合和吞噬原理示意圖

        3)CDC

        補體是存在于人或脊椎動物血清于組織液中一組不耐熱的,經活化后具有酶活性的蛋白質,共包括30余種可溶性蛋白和膜結合型蛋白。抗體的Fc片段能夠結合血清補體分子(C1q),繼而形成膜攻擊復合物(MAC)清除目的細胞。補體的激活過程是個級聯過程(圖4)。首先是識別階段:抗原與抗體結合后,C1q能識別抗體上的補體結合點,并與之結合。由于C1q的構型發生改變,可激活C1r和C1s;在Ca2+存在下,形成具有酶活性的C1s。接著是活化階段C1s 將C4分解成小碎片的C4a和大碎片的C4b,C4b可與細胞膜結合;C1s 激活C4后,再激活C2(分解成C2a和 C2b);C2b與C4b結合,形成有酶活性的C4b2b(C3轉化酶)。C3被C4b2b裂解在C3a和C3b兩個片段,C3b與C4b2b相結合產生的C4b2b3b為經典途徑的C5轉化酶。最后為攻膜階段 C5在 C4b2a3b的作用下裂解為C5a和C5b,C5b與細胞膜和 C6、C7結合,形成C5b67復合物,進而與 C8、C9分子聯結成C5b6789復合體,即為攻膜復合體,造成細胞膜溶解。


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        圖4 補體介導的細胞毒作用

        雖然許多治療性抗體恒定區都是人的IgG1的Fc,但它們激活補體的能力卻有極大的不同。激活補體不僅需要靶細胞表面表達較高密度的抗原,也需要抗體分子的高特異靶向性,高靶向性才能結合多個C1q并且有效激活補體。另外,位于細胞表面或者一些游離的補體抑制劑能夠有效阻斷補體級聯反應。腫瘤細胞在其細胞表面經常高表達一些補體抑制劑如CD46,CD55和CD59,這些分子能夠保護靶細胞免受補體介導的殺傷作用。因此,基于以上這些多因素的存在,導致許多IgG1的抗體只具有非常弱的CDC作用。

        與ADCC檢測實驗相比,CDC體外檢測相對簡單,先把靶細胞稀釋至特定密度,加至96孔板中,然后加入梯度稀釋好的抗體于37°孵育10-30min,然后加入補體,于37°孵育1-24h。但如果我們研究人的靶點以及其對應的嵌合抗體和人源化或是全人的抗體時,我們必須用人的血清,因為有些補體蛋白有物種特異性,特別是CD59。即使在前期的快速篩選抗體階段會用到兔血清,但有意義的數據還是需要人血清的。小鼠的血清在CDC實驗中效果很差而且鼠血清本身對靶細胞的毒性相當大。具體原因尚不清楚。因而用鼠血清做補體的CDC數據相對稀少。實驗中,有不同的方法測量靶細胞的裂解。最常用的是用非滲膜的熒光染料PI (propidium iodide),它能結合已裂解細胞的DNA,但是不能穿透正常細胞的細胞膜,然后通過流式檢測細胞的活率。LDH,calcein AM釋放等實驗也可以檢測CDC作用。

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