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      1. Shocker!Nature报道引发CAR-T细胞治疗后复发的罪魁祸首居然是它...

        Nature Medicine近期刊登了一篇有关单个CAR-B细胞诱导患者对CAR-T治疗耐受的文章:Inductionof resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of asingle leukemic B cell?#20445;?#26469;自宾夕法尼亚大学的研究团?#35825;?#23545;CAR-T治疗中出现的CAR转导白血病B细胞作了深入研究,旨在寻?#21307;?#21463;CAR-T治疗患者出现复发及身体衰竭的主要原因,以下为爱康得生物原创翻译。

        之前报告过一例接受CAR-T细胞(靶向CD19)治疗9个月后复发的B急淋病历,其CD19+白血病细胞异常表达CAR元件,在制备T细胞的过程中,CAR基因被稳定整?#29616;?#21333;个白血病B细胞基因组中,并表达在B细胞膜上与B细胞表面的CD19结合后实现自我掩蔽,躲过了CAR-T细胞(CTL019)的识别并赋予B细胞自身抵抗能力。

        抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞产品CTL019是第一个经FDA批准用于治疗儿童复发难治性急性B淋巴细胞白血病的基因修饰细胞疗法。尽管在B-ALL临床治疗中CTL019具有显著的疗效,但仍具有?#32454;?#30340;复发率,复发患者常出现B细胞不表达CD19的情况。

        一例20岁男性B-ALL患者(患者107#),在接受化疗及脐血移植复发后,参加了I期临床试验,以评估CTL019在儿童及年轻成人B-ALL患者中的安全性和有效性。预处理后,患者在2天内输注4.28×10^8个CTL019细胞。流式细胞仪检测显示CAR-T细胞在体内扩增的过程,一段时间后CAR-T细胞下降至外周血中无法通过流式细胞检出的状态;同时利用qPCR方法检测出CAR-T细胞在体内长期生存的过程(图1.a)。

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        患者在CTL019输注后第28天完全缓解(图1.b)。然而,通过qPCR检测外周血中CAR特定序列时发现,第252天CAR特征性基因拷贝数(CAR阳性细胞)出现第二次的扩增。但流式细胞仪检测结果证明此次扩增并非CAR-T细胞(图1.a)。在第261天,患者出现了明显的复发症状(图1.b)。免疫表型?#27835;?#32467;果进一步显示,这些表达CAR的细胞表型为CD3-CD10+CD22+CD45dim,它们?#23548;?#19978;是表达了CAR的B淋巴细胞(CAR-B)(图1.c)。由于这是一种进展性疾病,我们尝?#26434;?#38271;春新碱、泼尼松、巯基嘌呤和?#35013;?#34678;?#24335;?#34892;补救治疗,并伴以九个疗程的莫西单抗(抗CD22抗体)及靶向CD22的CAR-T细胞免疫治疗。然而,患者的CAR-B细胞?#20013;?#25193;增,最终死于与进展性白血病相关的并发症。

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        为了追踪CAR-B细胞的来源,我们利用下一代免疫球蛋白重链测序(IgH-seq)?#27835;?#20102;复发疾病的免疫球蛋白重链重排。这些细胞包含一个有效重排的等位基因和一个二?#27573;?#25928;重排的等位基因。这些重排存在于CTL019输注前单采血液样本中,证实其与原发白血病的克隆相关。我们因此假设了CAR-B复发是由体内复制型慢病毒(RCL)转导产生或在CTL019制备过程中产生。在输注CTL019后的第3、6、9、12和20个月采集外周血样本中并未检测到任何RCL(图1.d)。随即利用IgH-seq对属于CTL019制品中的CAR-B细胞?#27835;觶?#37492;定了白血病克隆型,结果表明CAR-B细胞是CTL019细胞制备期间出现的副产品。

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               ?#27835;鯟TL019产品中慢病毒载体结合位点随着时间的动态变化(图1.f),在放行产品中出现了2924个插入位点,输注患者体内后,这些位点在1个月内降至12个。在输注后第9个月复发时,其中两个插入位点占抽样的97%,?#24471;?#24930;病毒转染的B细胞正在进行克隆性增?#24120;?#31532;一个位点位于13号染色体上PCCA基因的第18内含子,第二个位点位于11号染色体神经纤毛蛋白-1(NRP1)基因下游的62.5kbps处(图1.g)。这两个结合位点在CTL019产品中无法检测到(图1.f),可能是出?#21046;德实?#20110;仪器检测阈值。虽然NRP1在B-ALL细胞中过度表达,但尚未有报道在急性淋巴细胞白血病中这两种基因异常。从患者体内分离白血病细胞?#27835;鯬CCA和NRP1的表达水平,结果表明患者入组时采集的淋巴细胞和复发后采集的淋巴细胞中PCCA和NRP1表达水平相似。因此,该患者复发并非慢病毒介导的CAR基因插入导致的NRP1或PCCA突变所?#38534;?br style="box-sizing: border-box; margin-bottom: 0px; margin-left: 0px; margin-right: 0px; margin-top: 0px; max-width: 100%; padding-bottom: 0px; padding-left: 0px; padding-right: 0px; padding-top: 0px; word-wrap: break-word;"/>

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        为了证实该患者白血病复发源自单个B细胞克隆,在小鼠体内扩增患者第9个月复发时采集的细胞,并进行单细胞分选,对5个基因进行?#27835;觶?#21253;括PCCA和NRP1(图1.g)。在所?#27835;?#30340;71个细胞中,通过靶向PCR?#27835;?#21457;现9个细胞在所有5个检测载体-宿主结合的结果均为阳性,证实复发性B细胞在CAR-T制备过程中产生的单克隆细胞。

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        患者107#复发的CD19阴性的白血病细胞中伴有CAR的异常表达。因此,我们首先需要了解CD19未表达的原因。复发的白血病细胞CD19阴性可能是由于突变、mRNA的选择性剪接或B细胞受体复合蛋白CD81的突变导?#38534;?#28982;而,在患者107#中并未发现以上异常。虽然通过流式细胞仪不能检测到CD19蛋白表达,但是在入组时单采的样本和复发后采集的样本中均可以检测到CD19的mRNA;而且,对复发后的骨髓样本进行免疫组织化学(IHC)染色?#27835;?#21457;现CD19的蛋白表达(图2.a)。用于IHC的OIT3B10抗体识别CD19胞内结构域。因此推断流式细胞仪未检测到CD19是由于CAR与CD19的结合后掩盖了流式抗体识别的CD19胞外表位。竞争性结合实验结果显示,流式细胞仪检测到的所有CD19细胞外表位特异性单克隆抗体,包括HIB19,均被FMC63(CD19 CAR单链抗体scFv)阻断。随后我们通过流式细胞术证实单克隆抗体OTI3B10(或EPR5906:另一种识别CD19胞内表位的特异性单抗)可正确结合患者入组时以及复发后样本中的CD19蛋白胞内段,而HIB19只能够与入组时患者的肿瘤细胞结合(图2.b)。由此我们证明CD19蛋白?#23548;?#19978;在复发的白血病细胞中有表达,但是它不能被识别胞外CD19表位的单克隆抗体结合,包括来源于CAR的单克隆抗体。为了评估CD19表达于细胞表面或仅表达于细胞内,我们使用共聚焦显微?#36947;?#26816;测CAR和CD19在复发性白血病细胞表面的共定位(图2.c)。

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        根据观察结果,CD19蛋白存在于白血病细胞表面,但不能被识别CD19胞外段的抗体检测到。因此,我们推测流式细胞术未检测到CD19是由于白血病细胞表面CAR与CD19结合,掩盖了流式细胞术检测的表位。我们成功地模拟了CAR转导的B-ALL细胞系(CD19+NALM-6)中的这种“表位掩蔽”现象,并利用标准流式细胞术检测出现CD19表达丢失的现象(图2.d)。但CD19转?#24613;救?#20445;留了下来(图2.e),并且能够观察到CD19和CD19特异性CAR蛋白(图2.f),这与我们从患者107#复发的CAR+19+B白血病细胞中的观察相符。CAR表达直接介导CD19表达的“丢失”。当CAR在强力霉素条件下诱导表达时,检测CD19表达“丢失?#20445;?#22270;2.g)。

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        在小鼠移植瘤模型中,CAR+ NALM6白血病细胞对CTL019介导的杀伤有抵抗力,但对抗CD22 CAR-T细胞无抵抗力(图2.h)。将107#患者复发的(CAR-B)细胞接种到小鼠体内,使用健康供体制备的CTL019 T细胞或靶向CD22 CAR-T细胞治疗,结果发现只有靶向CD22的CART细胞能够诱导缓解,表明107#患者复发不是由于患者自体CAR-T细胞的功能受损,而是由于B细胞膜表达CAR导致的内在白血病耐药机制(图2.i)

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        为了了解“表位掩蔽”的复发机制是否也适用于其他CAR-T细胞靶点,我们测试了靶向CD22的CAR疗法。表达CD22的NALM-6细胞分别转染了两个不同的靶向CD22的CAR(HA22-或m971单克隆抗体识别膜远端表位和膜近端表位)。在这个模型中,只有当流式细胞术检测用抗体与CAR结构中的scFv识别相同的CD22表位时,才会出现CAR-NALM6细胞表面CD22表达“丢失”的现象;而且CAR22+NALM6(HA22-或m971 CAR)细胞仅对表达相同CAR22单链抗体的CAR-T细胞具有耐药性。这些结果表明表位掩蔽可以介导对CAR-T的抗性,此结果与CTL019产品中观察到的一?#38534;?/p>


        爱康得原创翻译,英文原文源自Nature Medicine。


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