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      1. Shocker!Nature報道引發CAR-T細胞治療后復發的罪魁禍首居然是它...

        Nature Medicine近期刊登了一篇有關單個CAR-B細胞誘導患者對CAR-T治療耐受的文章:Inductionof resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of asingle leukemic B cell”,來自賓夕法尼亞大學的研究團隊針對CAR-T治療中出現的CAR轉導白血病B細胞作了深入研究,旨在尋找接受CAR-T治療患者出現復發及身體衰竭的主要原因,以下為愛康得生物原創翻譯。

        之前報告過一例接受CAR-T細胞(靶向CD19)治療9個月后復發的B急淋病歷,其CD19+白血病細胞異常表達CAR元件,在制備T細胞的過程中,CAR基因被穩定整合至單個白血病B細胞基因組中,并表達在B細胞膜上與B細胞表面的CD19結合后實現自我掩蔽,躲過了CAR-T細胞(CTL019)的識別并賦予B細胞自身抵抗能力。

        抗CD19嵌合抗原受體(CAR)T細胞產品CTL019是第一個經FDA批準用于治療兒童復發難治性急性B淋巴細胞白血病的基因修飾細胞療法。盡管在B-ALL臨床治療中CTL019具有顯著的療效,但仍具有較高的復發率,復發患者常出現B細胞不表達CD19的情況。

        一例20歲男性B-ALL患者(患者107#),在接受化療及臍血移植復發后,參加了I期臨床試驗,以評估CTL019在兒童及年輕成人B-ALL患者中的安全性和有效性。預處理后,患者在2天內輸注4.28×10^8個CTL019細胞。流式細胞儀檢測顯示CAR-T細胞在體內擴增的過程,一段時間后CAR-T細胞下降至外周血中無法通過流式細胞檢出的狀態;同時利用qPCR方法檢測出CAR-T細胞在體內長期生存的過程(圖1.a)。

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        患者在CTL019輸注后第28天完全緩解(圖1.b)。然而,通過qPCR檢測外周血中CAR特定序列時發現,第252天CAR特征性基因拷貝數(CAR陽性細胞)出現第二次的擴增。但流式細胞儀檢測結果證明此次擴增并非CAR-T細胞(圖1.a)。在第261天,患者出現了明顯的復發癥狀(圖1.b)。免疫表型分析結果進一步顯示,這些表達CAR的細胞表型為CD3-CD10+CD22+CD45dim,它們實際上是表達了CAR的B淋巴細胞(CAR-B)(圖1.c)。由于這是一種進展性疾病,我們嘗試用長春新堿、潑尼松、巰基嘌呤和甲氨蝶呤進行補救治療,并伴以九個療程的莫西單抗(抗CD22抗體)及靶向CD22的CAR-T細胞免疫治療。然而,患者的CAR-B細胞持續擴增,最終死于與進展性白血病相關的并發癥。

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        為了追蹤CAR-B細胞的來源,我們利用下一代免疫球蛋白重鏈測序(IgH-seq)分析了復發疾病的免疫球蛋白重鏈重排。這些細胞包含一個有效重排的等位基因和一個二級無效重排的等位基因。這些重排存在于CTL019輸注前單采血液樣本中,證實其與原發白血病的克隆相關。我們因此假設了CAR-B復發是由體內復制型慢病毒(RCL)轉導產生或在CTL019制備過程中產生。在輸注CTL019后的第3、6、9、12和20個月采集外周血樣本中并未檢測到任何RCL(圖1.d)。隨即利用IgH-seq對屬于CTL019制品中的CAR-B細胞分析,鑒定了白血病克隆型,結果表明CAR-B細胞是CTL019細胞制備期間出現的副產品。

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               分析CTL019產品中慢病毒載體結合位點隨著時間的動態變化(圖1.f),在放行產品中出現了2924個插入位點,輸注患者體內后,這些位點在1個月內降至12個。在輸注后第9個月復發時,其中兩個插入位點占抽樣的97%,說明慢病毒轉染的B細胞正在進行克隆性增殖;第一個位點位于13號染色體上PCCA基因的第18內含子,第二個位點位于11號染色體神經纖毛蛋白-1(NRP1)基因下游的62.5kbps處(圖1.g)。這兩個結合位點在CTL019產品中無法檢測到(圖1.f),可能是出現頻率低于儀器檢測閾值。雖然NRP1在B-ALL細胞中過度表達,但尚未有報道在急性淋巴細胞白血病中這兩種基因異常。從患者體內分離白血病細胞分析PCCA和NRP1的表達水平,結果表明患者入組時采集的淋巴細胞和復發后采集的淋巴細胞中PCCA和NRP1表達水平相似。因此,該患者復發并非慢病毒介導的CAR基因插入導致的NRP1或PCCA突變所致。

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        為了證實該患者白血病復發源自單個B細胞克隆,在小鼠體內擴增患者第9個月復發時采集的細胞,并進行單細胞分選,對5個基因進行分析,包括PCCA和NRP1(圖1.g)。在所分析的71個細胞中,通過靶向PCR分析發現9個細胞在所有5個檢測載體-宿主結合的結果均為陽性,證實復發性B細胞在CAR-T制備過程中產生的單克隆細胞。

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        患者107#復發的CD19陰性的白血病細胞中伴有CAR的異常表達。因此,我們首先需要了解CD19未表達的原因。復發的白血病細胞CD19陰性可能是由于突變、mRNA的選擇性剪接或B細胞受體復合蛋白CD81的突變導致。然而,在患者107#中并未發現以上異常。雖然通過流式細胞儀不能檢測到CD19蛋白表達,但是在入組時單采的樣本和復發后采集的樣本中均可以檢測到CD19的mRNA;而且,對復發后的骨髓樣本進行免疫組織化學(IHC)染色分析發現CD19的蛋白表達(圖2.a)。用于IHC的OIT3B10抗體識別CD19胞內結構域。因此推斷流式細胞儀未檢測到CD19是由于CAR與CD19的結合后掩蓋了流式抗體識別的CD19胞外表位。競爭性結合實驗結果顯示,流式細胞儀檢測到的所有CD19細胞外表位特異性單克隆抗體,包括HIB19,均被FMC63(CD19 CAR單鏈抗體scFv)阻斷。隨后我們通過流式細胞術證實單克隆抗體OTI3B10(或EPR5906:另一種識別CD19胞內表位的特異性單抗)可正確結合患者入組時以及復發后樣本中的CD19蛋白胞內段,而HIB19只能夠與入組時患者的腫瘤細胞結合(圖2.b)。由此我們證明CD19蛋白實際上在復發的白血病細胞中有表達,但是它不能被識別胞外CD19表位的單克隆抗體結合,包括來源于CAR的單克隆抗體。為了評估CD19表達于細胞表面或僅表達于細胞內,我們使用共聚焦顯微鏡來檢測CAR和CD19在復發性白血病細胞表面的共定位(圖2.c)。

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        根據觀察結果,CD19蛋白存在于白血病細胞表面,但不能被識別CD19胞外段的抗體檢測到。因此,我們推測流式細胞術未檢測到CD19是由于白血病細胞表面CAR與CD19結合,掩蓋了流式細胞術檢測的表位。我們成功地模擬了CAR轉導的B-ALL細胞系(CD19+NALM-6)中的這種“表位掩蔽”現象,并利用標準流式細胞術檢測出現CD19表達丟失的現象(圖2.d)。但CD19轉錄本卻保留了下來(圖2.e),并且能夠觀察到CD19和CD19特異性CAR蛋白(圖2.f),這與我們從患者107#復發的CAR+19+B白血病細胞中的觀察相符。CAR表達直接介導CD19表達的“丟失”。當CAR在強力霉素條件下誘導表達時,檢測CD19表達“丟失”(圖2.g)。

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        在小鼠移植瘤模型中,CAR+ NALM6白血病細胞對CTL019介導的殺傷有抵抗力,但對抗CD22 CAR-T細胞無抵抗力(圖2.h)。將107#患者復發的(CAR-B)細胞接種到小鼠體內,使用健康供體制備的CTL019 T細胞或靶向CD22 CAR-T細胞治療,結果發現只有靶向CD22的CART細胞能夠誘導緩解,表明107#患者復發不是由于患者自體CAR-T細胞的功能受損,而是由于B細胞膜表達CAR導致的內在白血病耐藥機制(圖2.i)

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        為了了解“表位掩蔽”的復發機制是否也適用于其他CAR-T細胞靶點,我們測試了靶向CD22的CAR療法。表達CD22的NALM-6細胞分別轉染了兩個不同的靶向CD22的CAR(HA22-或m971單克隆抗體識別膜遠端表位和膜近端表位)。在這個模型中,只有當流式細胞術檢測用抗體與CAR結構中的scFv識別相同的CD22表位時,才會出現CAR-NALM6細胞表面CD22表達“丟失”的現象;而且CAR22+NALM6(HA22-或m971 CAR)細胞僅對表達相同CAR22單鏈抗體的CAR-T細胞具有耐藥性。這些結果表明表位掩蔽可以介導對CAR-T的抗性,此結果與CTL019產品中觀察到的一致。


        愛康得原創翻譯,英文原文源自Nature Medicine。


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