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      1. 干货|细胞培养之二十问答

        1. 冷冻管应如何解冻?

                取出冷冻管后,须立即放入37°C水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则容易发生污染。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管爆?#36873;?/p>

        2. 细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除DMSO?

                除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)在解冻之后应直接放入含有10-15ml新鲜培养基的培养瓶中,待隔天再置换新鲜培养基去除DMSO即可,可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

        3. 能否使用与原先培养条件不同的培养基?

                不能。每一种细胞株均有其特定的细胞培养基,若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基,细胞大多无法立即适应,造成细胞无法存活。

        4. 能否使用与原先培养条件不同的血清种类?

                不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,血清的种类和品质对细胞的生长会产生极大影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。

        5. 何谓FBS,FCS,CS,HS ?

                FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思,两者都是指胎牛血清,FCS乃错误的使?#31859;?#30524;,请不要再使用。CS (calf serum) 则是?#24863;?#29275;血清。HS (horse serum) 则是指马血清。

        6. 培养细胞时应使用5%或10%的CO2?或根本没有影响?

                一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为pH的缓冲系?#24120;?#32780;培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓?#21462;?#24403;培养基中 NaHCO3含量为每公升3.7g时,细胞培养时应使用 10%的CO2;当培养基中 NaHCO3为每公升1.5g时, 则应使用5%的CO2培养细胞。

        7.?#38382;?#39035;更换培养基?

                视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据?#31995;?#26356;换时间,按时更换培养基即可。

        8.培养基中是否须添加抗生素?

                除特殊筛选系统外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。

        9.附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度?应如何处理?

                一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20°C,避免反复冷冻解冻造成trypsin的活性降低,并减少污染的机会。

        10.悬浮性细胞应如何传代处理?

                一般仅需?#20013;?#21152;入新鲜培养基于原培养瓶中,稀释细胞浓度即可。若培养液太多,可将培养瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。?#21046;?#26102;取出一部份含细胞的培养液至另一个新的培养瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。

        11. 如果想要将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

                如果想要回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1,000 rpm),5-10分钟,过高的转速,会造成细胞死亡。

        12.细胞的接?#32622;?#24230;如?#31283;?#23450;?

                依照细胞株基本数据?#31995;?#25509;?#32622;?#24230;或稀释的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多都是造成细胞无法生长的原因。

        13.细胞冷冻培养基的成份是什么?

                动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95%原来细胞生长用的新鲜培养基均?#28982;旌稀?strong>注意:由DMSO稀释时会放出大量热能,所以不可将DMSO直接加入细胞液中, 必须使?#20204;?#20808;行配制完成。

        14.DMSO的等级和无菌过滤的方式是什么?

                冷冻保存使用的DMSO等级,必须为细胞培养级的DMSO(如Sigma D2650),其本身为无菌状况。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO的裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO的尼龙材质滤膜。

        15.冷冻保存细胞的方法?

                冷冻保存方法一:冷冻管置于4°C 30-60分钟(-20°C 30分钟),-80°C 16-18小时(或隔夜),液氮可长期储存。

                冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3°C至–80°C以下,再放入液氮可长期储存。-20°C不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大?#20811;?#20129;,?#37096;?#36339;过此步骤直接放入-80°C冰箱中,但存活率会略有降低。

        16.细胞想要冷冻保存时,细胞冷冻管内应细胞浓度应该多少?

                冷冻管内细胞数目一般为?#25239;?x106 cells/ml,融合瘤细胞则以?#25239;?x106 cells/ml为宜。

         17.应如何避免细胞污染?

                细胞污染的种类可分为细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌?#21462;?#20027;要的污染原因为无菌操作技术不当、操作?#19968;?#22659;不?#36873;?#27745;染的血清和污染的细胞?#21462;Q细?#30340;无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。

        18.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

                直接灭菌后丢弃。

        19.支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否可?#21248;?#30524;观察出异状?

                不能。除极有经验的专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨。

        20.支原体污染会对细胞培养有何影响?

                支原体污染几乎可影响所有细胞的生长?#25353;?#35874;。所以进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果的数据才有意义。

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